K. Yoshikai,1 T. Kato2, Y. Matsuda1, M. Kato2, C. Arai1, S. Suzuki1, R. Hana1i, E. Nakano1, Y. Sawada1.3
T. Sawada1, H. Kurahashi2.
1 The Sawada Women’s clinic Fertility Center Nagoya Japan
2 Division of Molecular Genetics, ICMS (Institute for comprehensive Medical Science), Fujita Health University
3 Department of Obstetrics and Gynecology Nagoya City University Hospital

Background and Aims
Using spent blastocyst culture medium or blastocoel fluid (BF) is a noninvasive preimplantation genetic testing compared with Trophectoderm (TE) biopsy.
We performed a chromosome analysis using Next Generation Sequencing (NGS) to compare spent blastocyst culture medium and BF with ICM and TE deriving from the same blastocyst culture.

Material and Method
Vitrified-warmed blastocysts were cultured in 25μl droplets (CSCC with HAS (Irvine Scientific). After 12hours, BF was aspirated from the expanded blastocyst using an ICSI pipette (Oligio). The aspirated liquid was recovered by being discharged directly to 1.5μl PBS placed in the tube. ICM and TE biopsies were performed from re-expanding blastocyst and each sample was placed in the tube containing 1.5μl PBS. The spent culture medium was collected in amounts of 20μl from each sample. All biopsy materials were performed by whole-genome amplification and diagnosed by NGS. Karyotypic evaluation was performed by BlueFuse Multi software.

Result
A total of 45 blastocyst were biopsied that derived from validity data in 31 blastocyst. Amplification rate of BF (63.6%) and spent blastocyst culture medium (46.8%) were brought significantly low compared to ICM (97.8%) and TE (96.9%). Karyotypic concordance rate between BF and ICM was 58.8% and that comparing spent blastocyst culture medium with ICM, its concordance rate was 47.8%. Additionally, BF and spent blastocyst culture medium were many specimens that cannot be determined for karyotype due to high noise.

Conclusion
We can be successful to diagnose by NGS for BF and spent culture medium. A DNA derived from BF and medium are likely to come from apoptotic cells. Therefore, template DNA is fragmented, and its quality is low.
Chromosomal diagnose with BF and spent culture medium has the advantage of low invasiveness, however practical application is difficult because of discordance that it is judged by the fetal karyotype.

Y.matsuda(1), K.Yoshikai(1), T.kato(2), S.Mityai(1), C.Arai(1), S.Suzuki(1), M.Tomida(1), E.Nakano(1), Y.Sawada(1), T.Sawada(1), H. Kurahashi(2)

(1)The Sawada Women’s Clinic, Reproduction center, Nagoya Aichi Japan
(2)Fujita Health University, Division of Molecular Genetics-ICMS, Toyoake Aichi, Japan

Background and Aims
It is reported that the expanded size of blastocyst is associated with pregnancy outcome, and the larger the expansion, the higher the pregnancy rate. However, the degree of extension is evaluated based on Gardner, and objective comparison is difficult. We measured the size of the blastocoel and examined whether it relates to age and euploidy rate.

Methods
This study was performed using blastocysts continuously cultured in the EmbryoScope TL imaging incubator, those were obtained patient’s consent to use.
The size of the blastocyst was evaluated at 115 hours (day 5), the diameter was measured in two directions (horizontal direction and vertical direction), and the average value was used. Each blastocyst was subjected to whole genome amplification and diagnosed by NGS. Patient age was classified into three groups of under 34 years old (Group1), 35-39 years old (Group2), and over 40 years (Group3), and the size and ploidy of blastocysts were compared respectively.

Results
There was a correlation between the blastocyst size and the euploid rate by NGS.
The size of the blastocoel was significantly larger in Group1 than in Group3 (163.1 ±24.8 vs. 132.2±27.2). The euploid rate was related to the age and significantly decreased with age (62.5% vs. 14.3% vs. 0%).

Conclusions
The degree of expansion of the blastocoel was found to be related to maternal age and euploidy. Determining the size of the blastocoel in each age group was considered to be useful as embryo transfer parameter.

○吉貝香里1、松田有希野1、加藤武馬2、加藤麻希2、宮井俊輔2、新井千登勢1、鈴木篤智1、花井理沙1、中野英子1、倉橋浩樹2、澤田富夫1
1さわだウィメンズクリニック
2藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

目的
TE生検は侵襲性が低く胚の着床に影響しないことが報告されているが、胚盤胞内部の液体である胞胚腔液(Blastocoele fluid:BF)を用いたより侵襲性の低い方法も着目されている。また近年、培養液に染みでたDNAを鋳型にした染色体解析が低侵襲のスクリーニング法として報告された。本研究では、BFや培養液由来のDNAは、TEの代替えサンプルとして用いられるか検討した。
方法
当院の凍結基準を満たさず廃棄となった胚盤胞、または凍結後廃棄となった初期胚から得られた胚盤胞36個を用い、患者同意を得て研究を行った。胚盤胞期のICM, TE, BF, 培養液を各々採取し、全ゲノム増幅後、次世代シーケンサーで染色体検査を行った。得られた結果からBF, 培養液が初期胚の染色体検査に有用か、また存在する核型の由来をICMとTEで比較した。
結果
全ゲノム増幅成功率はBF、培養液、ICM、TE各々63.6％、46.8％、97.8％、96.9％で、BF、培養液がICM、TEに比較し有意に低かった。また染色体解析の結果、BF、培養液はICMやTEと比較してノイズが高く核型判定が不能となる検体が多かった。さらにICMやTEとの核型比較解析の結果、BFとの一致率は63.2％、培養液では52.0％、BFと培養液での一致率は38.9％であった。BF・培養液にはICMまたはTEには持たない染色体異常が多く散見された。培養液の染色体解析の結果、受精卵がXYの際にXのコピー数が上がりYのコピー数が下がる傾向があり性染色体の相違が認められた。
考察
これらの結果からBF、培養液中のDNAはICMやTE複数の染色体に異常を持つためにアポトーシスした細胞に由来する可能性が高いと考えられる。培養液の性染色体の相違については、透明体より卵丘細胞が完全に除去されていない可能性もあり、更なる検討が必要と思われる。以上の結果より、BF、培養液による染色体検査は、侵襲性が低いという利点はあるが、胎児の核型を判定しているとは言い難く、また判定不能のケースが多いことから、実用性は低いことが考えられる。

○松田　有希野1）、吉貝　香里1）、加藤　武馬2）、宮井　俊輔2）、加藤　麻希2）、新井　千登勢1）、鈴木　篤智1）、花井　里沙1）、中野　英子1）、倉橋　浩樹2）、澤田　富夫1）
1)さわだウィメンズクリニック、2)藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

目的
近年、受精後の初期胚で高頻度に染色体異常が発生することが知られている。IVFにおける体外培養の環境が異数体の発生頻度に影響するという報告もあり、卵胞刺激ホルモンや培養液が、受精後の異数体発生の原因ではないかと考えられている。本研究では、モザイク染色体異常を高感度に検出できる次世代シーケンサーを用いて、2種類の培養液を使用し、モザイク型の染色体異常の発生頻度に差があるか検討した。

方法
2013年2月～2017年7月までに採卵した39症例を対象とした。採卵後、体外受精または、顕微授精を行い、5日目(D5)または6日目(D6)で胚盤胞を凍結した。培養機器はEmbryo Scope®またはKシステムを使用し、培養条件は、37℃、O2　5.0％、N2　90％とし、対象期間中の条件の変化はなかった。培養は、シングルメディウムを使用した連続培養を行ったため、培養液交換は行わなかった。
使用した胚は、患者の同意が得られた廃棄胚盤胞であり、栄養外胚葉をNGSで染色体解析した。使用した培養液はA社、B社とした。次世代シークエンサーの結果は、構成型異数体を除き、正倍数とモザイクの結果のみ使用した。

結果
A社、B社それぞれ患者平均年齢は、34.0±4.0歳、33.8±4.2歳であり、有意差はなかった。D5胚の結果は、A社で正倍数胚群54.5％(6/11)、モザイク群45.5％(5/11)、B社で正倍数胚群50.0％(9/18)、モザイク群50.0％(9/18)であり、それぞれ有意差はなかった。また、D6胚では、A社で正倍数胚群100.0％(2/2)、モザイク群0％(2/2)、B社で正倍数胚群63.2％(12/19)、モザイク群36.8％(7/19)であり、それぞれ有意差はなかった。

考察
今回の検討では、2社の培養液の違いによるモザイク率の変化に有意差が認められなかったことから、培養液がモザイク現象の発生原因である可能性は低いと示唆された。
今後症例数を増やし検討していきたい。

新井　千登勢1)、吉貝　香里1)、加藤　武馬2)、加藤　麻希2)、宮井　俊輔2)、松田　有希野1)、鈴木　篤智1)、花井　里沙1)、中野　英子1)、倉橋　浩樹2)　、澤田　富夫1)、
1)さわだウィメンズクリニック, 2)藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

【目的】
胚盤胞の外側に割球(外割球)あるいは胚盤胞腔内に割球(内割球)が残存するものがしばしば観察される。これらの割球の発生原因は明らかになっていないが、多核細胞や一度分割した後に再融合を生じた細胞がcompactionの際に排除されて残存している場合が多い。今回我々は両割球がどのようなものであるかを探るため、外割球または内割球の細胞生検を行い、染色体解析を試みた。さらに、それらの割球を含む同一胚盤胞のICMやTEと染色体比較解析を行った。

【対象と方法】
当院で採卵・凍結後、廃棄となった胚盤胞のうち、外割球を有する20個と内割球を有する3個の計23個を用いた。対象胚は患者の同意を得て研究を行った。外割球採取の患者の採卵時の平均年齢は35.0±3.7歳、内割球は37.3±1.7歳であった。各胚盤胞から外割球または内割球とICM,TEをそれぞれ採取し、全ゲノム増幅後、次世代シークエンサーで染色体比較解析を行った。

【結果】
染色体解析の結果、外割球は正倍数性2個、異数性4個、モザイク型の異常2個、判定不能12個であった。内割球は異数性1個、判定不能2個であった。さらに、ICMやTEとの染色体比較解析の結果、外割球は5/20個が、内割球は1/3個が一致した。

【考察】
今回の解析で外割球と内割球は正倍数性のものは僅かであり、内・外割球に含まれるDNA量が少ない為、判定不能となるケースが多かった。それらは染色体が断片化されるアポトーシスの過程にあると考えられる。すなわち、外割球と内割球は染色体異常などの異常細胞を排除することにより、胚として自己修復を図っている過程を反映している可能性が示唆された。また、ICMやTEとの一致率が低く、胚の核型を反映しているとは言い難く、これらの割球をPGSやPGDの材料として用いることは出来ないが、胚の染色体異常の程度を測る指標の一つとして見なすことができるのではないかと考える。