学会・論文発表

NGS分析を用いた胚発育の後方視的解析 (第64回 日本生殖医学会)

松田 有希野1)、吉貝 香里1)、加藤 武馬2)、宮井 俊輔2)、新井 千登勢1)、鈴木 篤智1)、冨田 麻莉1)、中野 英子1)、倉橋 浩樹2)澤田 富夫1)、
1)さわだウィメンズクリニック、2)藤田医科大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

目的
胚の異数性を解析すると、施設間での培養状況や卵巣刺激法の違いにより差異があるという報告がある。さらに、媒精方法や、ICSI施行者の違いによる要因も考えられている。当院で得られた廃棄胚盤胞をNGSによって染色体解析し、胚発育状況を種々の要因で違いがあるか後方視的に検討した。

方法
2009年4月から2018年10月の間に採卵し、患者同意を得られた廃棄胚盤胞75症例142個を使用した。媒精方法、ICSI施行者の違いによる異数性の差異を検討した。NGS解析から、正倍数胚59個(41.5%)、構成型異数胚55個(38.7%)、モザイク異数胚28個(19.7%)であった。構成型異数胚は、患者年齢や卵巣刺激のような培養前の因子に大きく依存することから、正倍数胚とモザイク異数胚のみで検討した。

結果
正倍数胚率とモザイク異数胚率を媒精方法の違いからみると、C-IVFでは71.0%(22/31)、29.0%(9/31)であった。ICSIでは、66.1%(37/56)、33.9%(19/56)であり、C-IVFとICSIで正倍数胚率とモザイク異数胚率に有意差はなかった。また、ICSI施行者による正倍数胚率とモザイク異数胚率は、A者59.1%(13/22)、40.9%(9/22)、B者52.9%(9/17)、47.1%(8/17)、C者83.3%(10/12)、16.7%(2/12)であり、施行者間で有意差はなかった。また、異数性を示す染色体の数が1~2つのモザイク胚と、3つ以上ある複雑なモザイク胚をICSI施行者の違いで差があるか調べたところ、A者77.8%(7/9)、22.2%(2/9)、B者87.5%(7/8)、12.5%(1/8)、C者100%(2/2)、0%(0/2)であり施行者間で差はなかった。

考察
モザイク異数胚の発生率は年齢にかかわらず20%程であり、当院全体でのモザイク異数胚の発生率は同程度である。結果から媒精方法で差はなかったが、ICSI施行者の違いでは有意差はないものの個々で差があるように思われる。裸化やICSIを行う際の手法を見直すことによってモザイク異数胚率を減少させることができるのではないかと思われる。今後、症例数を増やし検討していきたい。

卵子の大きさと染色体異常の有無 (第37回 受精着床学会)

松田 有希野1)、吉貝 香里1)、加藤 武馬2)、宮井 俊輔2)、新井 千登勢1)、鈴木 篤智1)、冨田 麻莉1)、中野 英子1)、澤田 富夫1)、倉橋 浩樹2)

1)さわだウィメンズクリニック、2)藤田医科大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

 

【目的】

卵子のサイズが小さい、または囲卵腔が広い卵子は染色体異常である可能性が高いという報告がある。今回、私たちはEmbryo Scope®の画像結果と、NGSによる染色体解析結果を元に、卵子のサイズが染色体異常と関連しているか、また、卵子のサイズが年齢とともに変化するか検討した。

【方法】

2013年5月~2018年6月までに採卵し、患者同意の得られた49症例97個の胚を対象とした。卵子のサイズは、透明帯を含む卵子全体と、卵子細胞質の直径を測定した。NGSによる染色体解析結果から、正倍数胚群(N群31個)、構成型異常胚群(C群37個)、モザイク異常胚群(M群11個)に分類した。

また、年齢による影響を調べるため、34歳以下(a群)、35~38歳(b群)、39歳以上(c群)に分けて比較検討した。

【結果】

透明帯を含む卵子全体径は、N群158.1±6.6㎛、C群161.4±6.4㎛、M群159.5±5.2㎛であり、C群はN群より有意に大きかった。また、卵子細胞質径は、N群116.1±3.4㎛、C群116.9±2.8㎛、M群115.6±4.5㎛であり、有意差はなかった。年齢別では、卵子全体径は、a群158.3±6.5㎛、b群160.3±5.6㎛、c群162.5±6.5㎛であり、c群はa群より有意に大きかった。また、卵子細胞質径は、a群115.9±3.5㎛、b群116.3±3.1㎛、c群117.4±3.3㎛であり、有意差はなかった。さらに、卵子全体径が染色体異常に由来しているかを年齢別にN群、C群、M群で検討したところ、34歳以下N群156.7±6.3㎛、C群162.3±5.8㎛、35~38歳N群159.2±4.5㎛、C群159.8±6.2㎛、M群162.9±4.4㎛、39歳以上N群161.8±7.3㎛、C群161.9±6.9㎛、M群163.7±2.2㎛であり、34歳以下でC群はN群より有意に大きかった。

【考察】

卵子細胞質のサイズは染色体の状態や年齢による有意差はない。しかし、囲卵腔が広く、卵子全体が大きい胚は34歳以下では構成型異数胚である可能性が高いことがわかった。よって、34歳以下の患者の場合、卵子全体径が160㎛を超えてくる卵子は、凍結あるいは移植の順位を下げることが望ましい。

凍結胚移植における胚発育と移植のタイミングとの関連 (第41回 中部生殖医学会)

〇鈴木篤智、吉貝香里、松田有希野、新井千登勢、冨田麻莉、中野英子、澤田富夫

目的
以前より前核出現が早く、分割が早い胚は妊娠率が高いという報告がある。当院でも初期胚の凍結時には、発生時間を考慮し、発生が早く分割が良好な胚を選別し凍結を施行している。しかし初期胚の発生が遅い胚であっても、継続培養後胚盤胞に到達し、融解胚移植後着床する胚もあり、胚の発生と最適な移植のタイミングについて検討した。

方法
ART治療にて採卵し、Embryo Scope(ES)による連続培養の後、凍結胚移植を施行した患者(64症例172周期)を無作為に抽出した。患者の平均年齢は34.9±3.6歳であった。ESの画像から前核出現時間、前核消失時間、第一分割、第二分割、Compaction、Compactionから胚盤胞発生までの時間を測定した。初期胚移植(D2)と胚盤胞移植の結果をそれぞれ妊娠継続群(FB(+)群)、非妊娠群(PT(-)群)、流産群の3群に分類した。
3群における各発生時間と妊娠結果の関連を検討した。

結果
初期胚移植では、FB(+)群、PT(-)群、流産群で発生時間に有意差はないが、FB(+)群で他2群より発生時間が早い傾向にあった。胚盤胞移植では、Compactionから胚盤胞発生までの時間がFB(+)群で98.4±9.7時間、PT(-)群で95.5±10.3時間、流産群で91.4±6.1時間であり、流産群がFB(+)群と比較して有意に早いことがわかった。また、前核出現からCompactionまでの分割時間に有意差はないものの流産群が他2群より早い傾向にあった。

結論
初期胚では、発生時間が早いほど妊娠継続する傾向があることがわかった。よって初期胚を凍結保存する際は、発生の早い胚を選択するのがよいと考えられた。また、胚盤胞については、発生が早い胚が流産に至る原因として、これらの周期では、implantation windowの変化と移植のタイミングと合致していない可能性がある。移植にあたってはホルモン値や内膜の厚さを測定し、個別に移植のタイミングを計画する必要性があると考えられた。

Comprehensive chromosome analysis shows a low concordance rate with embryo, blastocoel fluid and spent blastocyst culture medium (第9回 アジア太平洋生殖医学会(ASPIRE))

K. Yoshikai,1 T. Kato2, Y. Matsuda1, M. Kato2, C. Arai1, S. Suzuki1, R. Hana1i, E. Nakano1, Y. Sawada1.3
T. Sawada1, H. Kurahashi2.
1 The Sawada Women’s clinic Fertility Center Nagoya Japan
2 Division of Molecular Genetics, ICMS (Institute for comprehensive Medical Science), Fujita Health University
3 Department of Obstetrics and Gynecology Nagoya City University Hospital

Background and Aims
Using spent blastocyst culture medium or blastocoel fluid (BF) is a noninvasive preimplantation genetic testing compared with Trophectoderm (TE) biopsy.
We performed a chromosome analysis using Next Generation Sequencing (NGS) to compare spent blastocyst culture medium and BF with ICM and TE deriving from the same blastocyst culture.

Material and Method
Vitrified-warmed blastocysts were cultured in 25μl droplets (CSCC with HAS (Irvine Scientific). After 12hours, BF was aspirated from the expanded blastocyst using an ICSI pipette (Oligio). The aspirated liquid was recovered by being discharged directly to 1.5μl PBS placed in the tube. ICM and TE biopsies were performed from re-expanding blastocyst and each sample was placed in the tube containing 1.5μl PBS. The spent culture medium was collected in amounts of 20μl from each sample. All biopsy materials were performed by whole-genome amplification and diagnosed by NGS. Karyotypic evaluation was performed by BlueFuse Multi software.

Result
A total of 45 blastocyst were biopsied that derived from validity data in 31 blastocyst. Amplification rate of BF (63.6%) and spent blastocyst culture medium (46.8%) were brought significantly low compared to ICM (97.8%) and TE (96.9%). Karyotypic concordance rate between BF and ICM was 58.8% and that comparing spent blastocyst culture medium with ICM, its concordance rate was 47.8%. Additionally, BF and spent blastocyst culture medium were many specimens that cannot be determined for karyotype due to high noise.

Conclusion
We can be successful to diagnose by NGS for BF and spent culture medium. A DNA derived from BF and medium are likely to come from apoptotic cells. Therefore, template DNA is fragmented, and its quality is low.
Chromosomal diagnose with BF and spent culture medium has the advantage of low invasiveness, however practical application is difficult because of discordance that it is judged by the fetal karyotype.

Relationship between patient age and blastocyst size in good embryo selection using NGS analysis (第9回 アジア太平洋生殖医学会(ASPIRE))

Y.matsuda(1), K.Yoshikai(1), T.kato(2), S.Mityai(1), C.Arai(1), S.Suzuki(1), M.Tomida(1), E.Nakano(1), Y.Sawada(1), T.Sawada(1), H. Kurahashi(2)

(1)The Sawada Women’s Clinic, Reproduction center, Nagoya Aichi Japan
(2)Fujita Health University, Division of Molecular Genetics-ICMS, Toyoake Aichi, Japan

Background and Aims
It is reported that the expanded size of blastocyst is associated with pregnancy outcome, and the larger the expansion, the higher the pregnancy rate. However, the degree of extension is evaluated based on Gardner, and objective comparison is difficult. We measured the size of the blastocoel and examined whether it relates to age and euploidy rate.

Methods
This study was performed using blastocysts continuously cultured in the EmbryoScope TL imaging incubator, those were obtained patient’s consent to use.
The size of the blastocyst was evaluated at 115 hours (day 5), the diameter was measured in two directions (horizontal direction and vertical direction), and the average value was used. Each blastocyst was subjected to whole genome amplification and diagnosed by NGS. Patient age was classified into three groups of under 34 years old (Group1), 35-39 years old (Group2), and over 40 years (Group3), and the size and ploidy of blastocysts were compared respectively.

Results
There was a correlation between the blastocyst size and the euploid rate by NGS.
The size of the blastocoel was significantly larger in Group1 than in Group3 (163.1 ±24.8 vs. 132.2±27.2). The euploid rate was related to the age and significantly decreased with age (62.5% vs. 14.3% vs. 0%).

Conclusions
The degree of expansion of the blastocoel was found to be related to maternal age and euploidy. Determining the size of the blastocoel in each age group was considered to be useful as embryo transfer parameter.