学会・論文発表一覧

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    2018年

  • 胚盤胞腔と培養液にみられる染色体核型の由来

    ○吉貝香里1、松田有希野1、加藤武馬2、加藤麻希2、宮井俊輔2、新井千登勢1、鈴木篤智1、花井理沙1、中野英子1、倉橋浩樹2、澤田富夫1
    1さわだウィメンズクリニック 
    2藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

    目的
    TE生検は侵襲性が低く胚の着床に影響しないことが報告されているが、胚盤胞内部の液体である胞胚腔液(Blastocoele fluid:BF)を用いたより侵襲性の低い方法も着目されている。また近年、培養液に染みでたDNAを鋳型にした染色体解析が低侵襲のスクリーニング法として報告された。本研究では、BFや培養液由来のDNAは、TEの代替えサンプルとして用いられるか検討した。
    方法
    当院の凍結基準を満たさず廃棄となった胚盤胞、または凍結後廃棄となった初期胚から得られた胚盤胞36個を用い、患者同意を得て研究を行った。胚盤胞期のICM, TE, BF, 培養液を各々採取し、全ゲノム増幅後、次世代シーケンサーで染色体検査を行った。得られた結果からBF, 培養液が初期胚の染色体検査に有用か、また存在する核型の由来をICMとTEで比較した。
    結果
    全ゲノム増幅成功率はBF、培養液、ICM、TE各々63.6%、46.8%、97.8%、96.9%で、BF、培養液がICM、TEに比較し有意に低かった。また染色体解析の結果、BF、培養液はICMやTEと比較してノイズが高く核型判定が不能となる検体が多かった。さらにICMやTEとの核型比較解析の結果、BFとの一致率は63.2%、培養液では52.0%、BFと培養液での一致率は38.9%であった。BF・培養液にはICMまたはTEには持たない染色体異常が多く散見された。培養液の染色体解析の結果、受精卵がXYの際にXのコピー数が上がりYのコピー数が下がる傾向があり性染色体の相違が認められた。
    考察
    これらの結果からBF、培養液中のDNAはICMやTE複数の染色体に異常を持つためにアポトーシスした細胞に由来する可能性が高いと考えられる。培養液の性染色体の相違については、透明体より卵丘細胞が完全に除去されていない可能性もあり、更なる検討が必要と思われる。以上の結果より、BF、培養液による染色体検査は、侵襲性が低いという利点はあるが、胎児の核型を判定しているとは言い難く、また判定不能のケースが多いことから、実用性は低いことが考えられる。

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  • 培養液の違いによるモザイク発生頻度の比較検討

    ○松田 有希野1)、吉貝 香里1)、加藤 武馬2)、宮井 俊輔2)、加藤 麻希2)、新井 千登勢1)、鈴木 篤智1)、花井 里沙1)、中野 英子1)、倉橋 浩樹2)、澤田 富夫1)
    1)さわだウィメンズクリニック、2)藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

    【目的】
    近年、受精後の初期胚で高頻度に染色体異常が発生することが知られている。IVFにおける体外培養の環境が異数体の発生頻度に影響するという報告もあり、卵胞刺激ホルモンや培養液が、受精後の異数体発生の原因ではないかと考えられている。本研究では、モザイク染色体異常を高感度に検出できる次世代シーケンサーを用いて、2種類の培養液を使用し、モザイク型の染色体異常の発生頻度に差があるか検討した。

    【方法】
    2013年2月~2017年7月までに採卵した39症例を対象とした。採卵後、体外受精または、顕微授精を行い、5日目(D5)または6日目(D6)で胚盤胞を凍結した。培養機器はEmbryo Scope®またはKシステムを使用し、培養条件は、37℃、O2 5.0%、N2 90%とし、対象期間中の条件の変化はなかった。培養は、シングルメディウムを使用した連続培養を行ったため、培養液交換は行わなかった。
    使用した胚は、患者の同意が得られた廃棄胚盤胞であり、栄養外胚葉をNGSで染色体解析した。使用した培養液はA社、B社とした。次世代シークエンサーの結果は、構成型異数体を除き、正倍数とモザイクの結果のみ使用した。

    【結果】
    A社、B社それぞれ患者平均年齢は、34.0±4.0歳、33.8±4.2歳であり、有意差はなかった。D5胚の結果は、A社で正倍数胚群54.5%(6/11)、モザイク群45.5%(5/11)、B社で正倍数胚群50.0%(9/18)、モザイク群50.0%(9/18)であり、それぞれ有意差はなかった。また、D6胚では、A社で正倍数胚群100.0%(2/2)、モザイク群0%(2/2)、B社で正倍数胚群63.2%(12/19)、モザイク群36.8%(7/19)であり、それぞれ有意差はなかった。

    【考察】
    今回の検討では、2社の培養液の違いによるモザイク率の変化に有意差が認められなかったことから、培養液がモザイク現象の発生原因である可能性は低いと示唆された。
    今後症例数を増やし検討していきたい。

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  • 胚盤胞の外側または胚盤胞腔内に存在する割球のNGSによる解析

    新井 千登勢1)、吉貝 香里1)、加藤 武馬2)、加藤 麻希2)、宮井 俊輔2)、松田 有希野1)、鈴木 篤智1)、花井 里沙1)、中野 英子1)、倉橋 浩樹2) 、澤田 富夫1)、
    1)さわだウィメンズクリニック, 2)藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

    【目的】
    胚盤胞の外側に割球(外割球)あるいは胚盤胞腔内に割球(内割球)が残存するものがしばしば観察される。これらの割球の発生原因は明らかになっていないが、多核細胞や一度分割した後に再融合を生じた細胞がcompactionの際に排除されて残存している場合が多い。今回我々は両割球がどのようなものであるかを探るため、外割球または内割球の細胞生検を行い、染色体解析を試みた。さらに、それらの割球を含む同一胚盤胞のICMやTEと染色体比較解析を行った。

    【対象と方法】
    当院で採卵・凍結後、廃棄となった胚盤胞のうち、外割球を有する20個と内割球を有する3個の計23個を用いた。対象胚は患者の同意を得て研究を行った。外割球採取の患者の採卵時の平均年齢は35.0±3.7歳、内割球は37.3±1.7歳であった。各胚盤胞から外割球または内割球とICM,TEをそれぞれ採取し、全ゲノム増幅後、次世代シークエンサーで染色体比較解析を行った。

    【結果】
    染色体解析の結果、外割球は正倍数性2個、異数性4個、モザイク型の異常2個、判定不能12個であった。内割球は異数性1個、判定不能2個であった。さらに、ICMやTEとの染色体比較解析の結果、外割球は5/20個が、内割球は1/3個が一致した。

    【考察】
    今回の解析で外割球と内割球は正倍数性のものは僅かであり、内・外割球に含まれるDNA量が少ない為、判定不能となるケースが多かった。それらは染色体が断片化されるアポトーシスの過程にあると考えられる。すなわち、外割球と内割球は染色体異常などの異常細胞を排除することにより、胚として自己修復を図っている過程を反映している可能性が示唆された。また、ICMやTEとの一致率が低く、胚の核型を反映しているとは言い難く、これらの割球をPGSやPGDの材料として用いることは出来ないが、胚の染色体異常の程度を測る指標の一つとして見なすことができるのではないかと考える。
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  • NGSによる染色体解析からみた良好胚盤胞の選択基準

    ○松田 有希野1)、吉貝 香里1)、加藤 武馬2)、宮井 俊輔2)、加藤 麻希2)、新井 千登勢1)、鈴木 篤智1)、花井 里沙1)、中野 英子1)、倉橋 浩樹2)、澤田 富夫1)
    1)さわだウィメンズクリニック、2)藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

    【目的】
    我々は、染色体正倍数の胚は、異数性胚に比べ、拡張胚盤胞の直径が大きいこと、Compactionに関与する細胞数が多いことを報告した。この際、配偶子形成過程で発生する構成型異常胚と受精後の初期胚で発生するモザイク型異常胚の2つをまとめて異数性として検討したが、今回、異数性を構成型とモザイク型の2つに分類し、再検討した。

    【方法】
    患者の同意を得られた廃棄胚盤胞(46個、患者平均年齢33.6±4.1歳)をNGSにより染色体解析を行った。胚盤胞は、正倍数群(N群14個)、構成型異数性群(C群12個)、モザイク群(M群11個)、構成型異数性とモザイクの両方を持つ混合群(CCA群9個)に分類した。検討項目は、Compaction完了時間、Compaction時細胞数、Compaction に関与した細胞数、胚盤胞到達時間、培養115時間時の胚盤胞の直径サイズとした。

    【結果】
    平均年齢はN群32.6±2.9歳、C群36.2±4.4歳、M群32.7±3.8歳、CCA群37.3±3.2歳であり、N群、M群に対してC群とCCA群は有意に年齢が高かった。Compaction完了時間とCompaction時細胞数については4群間に有意差がなかった。しかし、Compactionに関与した細胞数は、N群(9.5±1.9個)と比較してC群(7.7±2.4個)、M群(7.8±2.0個)で有意に少なかった。また、胚盤胞到達時間はN群(96.9±4.1時間)と比較して他の3群が有意に遅かった。(C群105.3±7.5時間、M群102.6±8.7時間、CCA群101.3±7.0時間)さらに、培養115時間時の胚盤胞サイズは、N群(168.6±24.9μm)と比較し、M群(150.3±22.7μm)とCCA群(154.4±15.5μm)において有意差はないものの、C群(141.6±26.1μm)は有意に小径であった。

    【考察】
    今回の結果より、培養115時間時、小径胚盤胞は構成型異常をもつ胚である可能性が示唆された。また、Compactionに関与した細胞数が少ない胚や、胚盤胞到達時間が、100時間を超えてくる胚についても、染色体異数性を持つ胚である可能性が示唆された。以上の結果より、凍結や移植を行う胚の優先順位付けの際にこの条件に従い、妊娠率や流産率への影響を検討していきたい。
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  • 同一患者間におけるCaイオノフォアによる卵子活性化の効果の検討

    〇新井 千登勢、吉貝 香里、松田有希野、中野 英子、澤田 富夫

    【目的】
    Caイオノフォア(以下Ca)は精巣精子や不動精子使用時に、卵子活性化が起こらず不受精となるのを回避する目的で使用されてきた。また、胚発育遅延、胚盤胞到達率が低い症例にも有効であるとの報告もある。当院で採卵を行い、低受精率や分割不良、精子運動性不良が見られた同一患者間において、Ca施行前後の成績を後方視的に検討した。

    【対象】
    2013年1月~2017年12月に採卵し、ICSI後Caを施行した患者10名、平均年齢36.5±3.5歳を対象とした。同一患者間で、Ca非施行周期とCa施行周期において、受精率、分割率、着床率、臨床妊娠率、出産率を比較した。また、2016年1月~12月に採卵・ICSI後Ca非施行患者の中から無作為抽出したノーマル群とCa施行群で受精率、分割率を比較した。

    【結果】
    同一患者間でのCa非施行周期とCa施行周期の受精率は47.8% vs. 87.4%で有意な差があった。分割率は100% vs.100%、着床率は6.3% vs. 37.0%、臨床妊娠率は6.3% vs. 29.6%、出産率は6.3% vs. 11.1% であり、分割率と臨床妊娠率、出産率に有意な差はなかったが、着床率に有意な差があった。さらに、この5項目をICSIの際に使用した精子別(新鮮精子・凍結精子・TESE精子・MESA精子)に分け、Ca非施行周期・施行周期を比較した結果、新鮮精子と凍結精子を用いたCa施行周期において受精率に有意な差があった。また、ノーマル群とCa施行群の受精率、分割率は80.5% vs.87.4%、98.1% vs. 100%であり、有意な差はなかった。

    【考察】
    Ca処理の必要な患者において、受精率と着床率が飛躍的に向上した。過去に受精障害や胚発生不良があった場合の改善策として、また不良な新鮮精子や凍結精子を使用する場合も、Caを施行することが有用であると考える。今後症例数を増やし更なる検討を行うとともに、1回のICSIでCa施行群と非施行群に分けた比較検討も必要である。
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