冨田　麻莉 , 渡辺　真一 , 鈴木　篤智 , 松田　有希野 , 吉貝　香里 , 中野　英子 ,

澤田　富夫

【目的】

凍結融解胚盤胞移植を行う際、胚融解後の拡張状態が良好な場合は移植成績も良好であるとの報告は多いが、融解直後と融解数時間後の形態とを関連付けた報告や融解数時間後の胚観察の必要性について論じた報告は少ない。

今回、単一胚盤胞移植を行った胚の融解直後及び移植時の形態が妊娠率と流産率に関連するかを調査し、また、融解胚盤胞の観察の必要性について検討を行った。

【対象と方法】

2019年9月-2021年12月に単一胚盤胞移植を行った248個の胚盤胞を対象として、融解直後と移植時(融解2-4時間後)に胚盤胞の拡張状態を観察記録した。

融解直後の胚形態によって拡張群(囲卵腔が観察されなかった胚)、収縮群(囲卵腔が観察された胚)の2群に分類した。融解直後に外周1/3-1/2のレーザーAHAを行った。

移植時の胚形態は脱出中(完全脱出を含む)、拡張、収縮の3類に分類し、それぞれについて移植成績の比較検討を行った。

【結果】

対象胚は融解直後の形態によって、拡張群161個、収縮群87個に分類された。各群の妊娠率及び流産率は、拡張群37.9%(61/161), 21.3%(13/61)、収縮群29.9%(26/87), 23.1%(6/26)であり、いずれも有意差は認められなかった。

移植時の形態ごとの妊娠率及び流産率は、拡張群では脱出中38.8%(40/103), 22.5%(9/40)、拡張34.9%(15/43), 13.3%(2/15)、収縮40.0%(6/15), 33.3%(2/6)、収縮群では、脱出中34.1%(15/44), 0%(0/15)、拡張33.3%(10/30), 30.0%(3/10)、収縮7.7%(1/13), 0%(0/1)であり、2群いずれも移植時の形態による妊娠率、流産率に有意差は認められなかった。

【結論】

融解直後拡張していた胚盤胞では、移植時の形態は移植成績に関連しなかったため、融解数時間後の観察は不要と考えられた。

融解直後収縮していた胚盤胞では、移植時に収縮していた場合の移植成績に有意差はないが低い傾向にあったため、融解数時間後の形態観察により妊孕能の推測ができる可能性が示唆された。

Shinichi Watanabe1, Kaori Yoshikai1, Mari Tomida1, Shigenori Suzuki1, Yukino Matsuda1, Shunsuke Miyai2, Eiko Nakano1, Hiroki Kurahashi2, Tomio Sawada1

1 Sawada Women’s Clinic, Nagoya, Japan

2 Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, Toyoake, Japan

Study question:

How do the blastomeres formed by direct cleavage (dynamics of one cell dividing into three or more cells) subsequently develop?

Summary answer:

About half of the blastomeres by direct cleavage did not form blastocysts.

What is known already:

There are many reports that embryos with direct cleavage in the early development have a lower blastocyst development rate because direct cleavage produces chromosomal abnormal cells. However, when such embryos develop into blastocysts, there have been some reports that the transfer pregnancy rate and euploid rate did not decrease, but the reasons for this have not been clarified.

Study design, size, duration:

This is a retrospective study of 89 blastocysts obtained during 2013-18.These embryos were those that patients requested to be discarded and consented to be used in this study. All target embryos were time-lapse monitored by EmbryoScope (Vitrolife, Sweden), and several trophectoderms were biopsied and examined for euploidy.

Participants/materials, setting, methods:

The target embryos were classified into three groups: embryos with normal first and second cleavage (NC group), embryos with irregular division (one cell dividing into three or more cells) called direct cleavage at the first cleavage (DC1 group), and embryos with direct cleavage of one blastomere at the second cleavage (DC2 group). It was recorded whether the blastomeres of the embryos subsequently developed into blastocysts or not. NGS analysis was performed on the embryos.

Main results and the role of chance:

The target embryos were classified as 48 in the NC group, 32 in the DC1 group, and 9 in the DC2 group. Whether the blastomeres in the target embryos subsequently formed blastocysts or not was recorded one by one by time-lapse images, resulting in the blastomeres’ blastocyst formation rate was 95.1% in the NC group and 55.9% in the DC1 group, which was significantly lower in the DC1 group (P<0.01). In the DC2 group, blastomeres formed by normal division and those by direct cleavage at the second cleavage were recorded separately, and the blastocyst formation rate was 90.8% for normal cleavage blastomeres and 46.0% for direct cleavage blastomeres, with significantly lower rates for direct cleavage blastomeres (P<0.01). Therefore, about half of the blastomeres generated by direct cleavage at the first or second cleavage did not form blastocysts. The results of NGS analysis were as follows: NC group: 35.4% euploid, 45.8% aneuploid, and 18.8% mosaic; DC1 group: 37.5%, 53.1%, and 9.4%, respectively; and DC2 group: 55.6%, 33.3%, and 11.1%, respectively. There was no significant difference in any of the items, suggesting that direct cleavage does not affect the euploidy of blastocysts.

Limitations, reasons for caution:

For the purpose of NGS analysis, all the target embryos in this study were blastocysts, but if all the cultured embryos were included, arrested embryos would be included, which would probably result in more blastomeres formed by direct cleavage not developing into blastocysts.

Wider implications of the findings:

The blastomeres generated by direct cleavage were often excluded from blastocyst formation. This may be an exclusion of chromosomally abnormal cells and may be one of the reasons why direct cleavage decreases blastocyst development rate but does not decrease blastocyst euploid rate.

渡辺　真一

胚の動態から妊孕性を推測する試みが数多く報告されているが、我々は特に不規則な初期分割動態に着目している。Direct cleavage（以下DC）と呼ばれる1細胞が3細胞以上に分割する動態が知られており、これによる染色体分配異常が懸念される。発生初期のDCは胚盤胞発生率を大きく低下させる。しかしDCを呈しても胚盤胞に到達した胚であれば移植妊娠成績への影響はないという報告は多い。我々はDCの胚盤胞正倍数性への影響を探るため、患者同意が得られた廃棄胚盤胞を用いて初期動態とNGS解析結果の関連を検討したところ、第二分割まで正常であった胚盤胞と第二分割までにDCが見られた胚盤胞の正倍数率に有意差は見られなかった（2020卵子学会）。

ではなぜDCは胚盤胞発生率を低下させるのに胚盤胞正倍数性には影響しないのか？　原因を探るべく、我々はDCで発生した割球のその後の「運命」を見ることとした。Day2胚の割球を1個ずつ、その後胚盤胞を形成しているかを観察したところ、第二分割まで正常であった割球は88%が胚盤胞を形成したのに対し、第一分割のDCで発生した割球の胚盤胞形成率は29%であった。加えて、第二分割時に2細胞のうち1個は正常分割だが1個はDCを呈した胚について両者を区別して同様に観察したところ、正常分割割球の胚盤胞形成率71%に対してDC由来割球のそれは34%と概ね同様であり、第二分割までのDCで発生した割球の約7割は胚盤胞を形成していなかった（2020中部生殖医学会）。

これらのことから、DCで発生した染色体異常細胞はアポトーシスや細胞接着能の欠損等により多くが胚盤胞形成から除外されており、胚盤胞到達後の正倍数性には影響がないことが推測された。実際の移植胚選択においては、DC胚は初期胚移植から除外し、胚盤胞に到達すれば通常通り移植を行うことが推奨されよう。

初期不規則分割としてもう一つ、Reverse cleavage（以下RC）と呼ばれる一旦分割した細胞が融合する動態が知られるが、RCの胚発生や正倍数性への影響については過去の報告でも意見の一致をみていない。我々も検討を行ったところ、第二分割まで正常分割の胚に比して、第二分割までにRCが見られた胚の胚盤胞発生率と初期胚移植妊娠率は低下したが、胚盤胞移植妊娠率は低下しなかった（本学術集会一般演題にて報告予定）。また、胚盤胞正倍数率は第二分割まで正常であった胚よりRC胚が有意に高いという不可解な結果となった（2020卵子学会）。現在我々はRCについて、正常に分割した割球が融合する「真のRC」と、DCの後に起こる「見かけのRC」があると考えている。これが未だ不明瞭なRCの機序や影響を解き明かす鍵になることを期待している。

鈴木篤智、渡辺真一、冨田麻莉、松田有希野、吉貝香里、中野英子、澤田富夫

【目的】

初期発生における不規則な分割として、一度分割した胚が融合するreverse cleavage（以下RC）と呼ばれる現象が知られているが、発生能や妊孕性への影響は分かっていない。

今回RC胚を詳細に観察し、胚発生能、妊孕能を検討した。

【対象と方法】

2016-20年にタイムラプスモニタリングされた胚1137個を対象として、第二分割までにRCが観察された胚をRC群、第一第二分割正常胚を正常群とし、良好胚盤胞発生率（Gardner分類4BC以上）、移植妊娠率を比較した。

さらに、1細胞が3細胞以上に分割（direct cleavage : DC）した後にRCが観察された胚をDC-RC群、正常分割後にRCが観察された胚をNC-RC群とし、良好胚盤胞発生率を比較した。

【結果】

初期胚移植妊娠率はRC群14.1％（10/71）、正常群27.0％（79/293）でRC群が有意に低率であった(P<0.05)。胚盤胞移植妊娠率はRC群42.1％（16/38）、正常群39.0％（41/105）で有意差は認めなかった。

良好胚盤胞発生率は、RC群、正常群ではそれぞれ34.5％（81/235）、66.7％（276/414）でRC群が有意に低く（P<0.01）、DC-RC群、NC-RC群ではそれぞれ37.6％（77/205）、13.3％（4/30）でNC-RC群が有意に低く（p<0.01）、DC-RC群のうち第一分割RC胚では37.2％（54/145）、第二分割RC胚では38.3％（23/60）、NC-RC群のうち第一分割RC胚では0.0％（0/21）、第二分割RC胚では44.4％（4/9）であった。

【考察】

RCは良好胚盤胞発生率、初期胚移植妊娠率を低下させたが、胚盤胞移植妊娠率を低下させなかったことから、胚盤胞に発育すれば移植可能と考えられた。

また、正常第一分割後にRCが見られた胚は良好胚盤胞を形成しなかったが、それ以外のRCでは形成が見られており、融合しなかった細胞が胚盤胞発生能を保持していると考えられた。

渡辺 真一¹　吉貝 香里¹　冨田 麻莉¹　鈴木 篤智¹　松田 有希野¹

宮井 俊輔²　中野 英子¹　倉橋 浩樹²　澤田 富夫¹

1 さわだウィメンズクリニック　2 藤田医科大学総合医科学研究所分子遺伝学研究部門

【緒言】

初期分割でDirect cleavage（1細胞が3細胞以上に分割する現象、以下DC）が観察された胚は胚盤胞発生率が低下するが、胚盤胞に到達すれば移植成績および正倍数率は低下しないとの報告が多く見られる。だがその理由は明らかでないため、原因を探るべくDCで発生した割球のその後の発育を観察、検討した。

【対象と方法】

2013-18年に採卵されEmbryoScope(Vitrolife)でタイムラプスモニタリングされた胚のうち、患者同意を得た廃棄胚盤胞89個を対象とした。第一分割でDCが見られた胚（DC1群）について割球のその後の発育を観察して「分割停止、または分割は進むがコンパクションしない」「胚盤胞化」の2類に分類し、胚盤胞化割球の割合を算出した。第一分割正常だが第二分割で1つの割球にDCが見られた胚（DC2群）、第一・第二分割正常胚（正常群）の割球も同様に分類して比較した。対象胚にはTE生検・NGS解析を行った。

【結果】

胚盤胞数はDC1群32個、DC2群9個、正常群48個であった。

割球の胚盤胞化率はDC1群55.9%、正常群95.1%で、DC由来割球の胚盤胞化率は有意に低かった（P<0.01）。

またDC2群における割球の胚盤胞化率はDC由来割球46.0%、正常分割割球90.8%で、DC由来割球の胚盤胞化率は有意に低かった（P<0.01）。

NGS解析結果はDC1群：正倍数性37.5%、異数性53.1%、モザイク9.4%、DC2群：それぞれ55.6%, 33.3%, 11.1%, 正常群：それぞれ35.4%, 45.8%, 18.8%で、いずれの項目も有意差はなかった。

【結論】

第二分割までのDC由来割球のおよそ半数が胚盤胞を構成しなかった。これはDCで発生した染色体異常細胞の除外と考えられ、DCが胚盤胞発生率を低下させるが胚盤胞の正倍数率を低下させない理由の一つであると推測された。